Spektrofotometri

A.      Pengertian

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

           B.      Komponen Utama Spektrofotometri

1.    Sumber Cahaya

2.    Pengatur Intensitas

3.    Monokromator

4.    Kuvet

5.    Detektor

6.    Penguat (amplifier)

           C.      Hukum Lambert-Beer

           Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung

           banyaknya cahaya yang dihamburkan:

 

           Dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

           Dimana I₀ merupakan intensitas cahaya datang dan I_t atau I₁ adalah intensitas

           cahaya setelah melewati sampel.

           Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai: 

           Dimana:

           A = Absorbansi

           a = Tetapan absorbtivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm)

           c = Konsentrasi larutan yang diukur

           ε = Tetapan absorbtivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam

                 ppm)

           b atau terkadang digunakan l = Tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga

                                                             umumnya 1cm)

           Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan

           yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:

1.    Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).

2.    Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.

3.    Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.

4.    Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.

5.    Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.

           D.      Jenis-jenis Spektrofotometri Berdasarkan Sumber Cahaya Yang Digunakan

1.    Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun, selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sampel yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

2.    Spektrofotometri Ultraviolet (UV)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.

Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

3.    Spektrofotometri UV-VIS

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.

4.    Spektrofotometri Infra Red (IR)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000μm.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

           Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja

           yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang

           memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang

           gelombang yang digunakan.

           E.       Fungsi Masing-masing Alat

1.    Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk spektrofotometer:

a.    UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

b.    VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

c.     UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.

d.    Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2.    Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

3.    Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel.

a.    UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.

b.    IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

4.    Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

a.    Kepekaan yang tinggi

b.    Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

c.     Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

d.    Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi

e.    Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

Macam-macam detektor:

a.    Detektor foto (Photo detector)

b.    Photocell, misalnya CdS

c.     Phototube

d.    Hantaran foto

e.    Dioda foto

f.     Detektor panas

5.    Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.

           F.       Cara Kerja

1.    Sumber cahaya polikromatis masuk ke dalam monokromator (disini terjadi penyebaran cahaya)

2.    Dari monokromator kemudian keluar menuju ke sel sampel,  pada sel sampel ini terjadi proses penyerapan cahaya oleh zat yang ada dalam sel sampel (dimana cahaya yang masuk lebih terang dibandingkan cahaya setelah keluar)

3.    Selanjutnya cahaya ditangkap oleh detektor dan mengubahnya menjadi arus listrik